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浓集自体骨髓单个核细胞治疗股骨头坏死

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发表于 2015-2-12 16:16:08 | 显示全部楼层 |阅读模式
  股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)可分为非创伤和创伤性两大类。在我国,引起非创伤性ONFH的主要原因为应用糖皮质激素(又称皮质类固醇 corticosteroid,以下简称激素)及长期大量饮酒,其它少见原因如镰状细胞贫血、减压病、高雪氏病等。创伤性ONFH的主要原因为移位的股骨颈骨折,其次为髋臼骨折、髋关节脱位等。有时髋部无明显骨折脱位,但有严重的髋部扭挫伤也会发生股骨头坏死,推测系髋关节内血肿引起股骨头血循环障碍所致。

  我国系骨坏死大国。依可靠依据推测,我国每年新发ONFH在15~30万之间,累积需治疗病例可达500~700万,此数字仍有逐年增高的趋势。对ONFH的自然病程研究显示,未经有效治疗,约70%~75%的ONFH从开始发病算起,在1~5年将进展到股骨头塌陷。股骨头一旦塌陷,约87%塌陷的股骨头将在1~3年内进展到必须行人工关节置换的程度。由于ONFH,特别是非创伤性ONFH多累及中青年(美国Mont报告平均38岁,中国李子荣报告38.6±11.5岁)。研究显示,中青年人工髋关节置换的中长期(≥20年)疗效仍难预料。因此,寻求保存患者自身关节的治疗(joint-preserving procedures)的有效方法势在必行。

  目前临床应用保存关节的治疗方法很多,归纳起来包括非手术治疗(中西药物、保护性负重、电磁场、高压氧等);微创治疗(体外震波、细针髓心减压等);病灶清除加各类植骨术(打压植骨、带血管或不带血管腓骨、髂骨移植、带肌蒂移植、多孔钽棒支撑等);截骨术(经股骨转子旋转截骨、内、外翻截骨等)。各种疗法,如适应证选择恰当,均有一定疗效。但目前研究发现,各类植骨术失败的共同原因系股骨头坏死的软骨下骨板不能得完全及有效的修复,最终导致关节软骨面塌陷而使关节功能受损,细胞治疗包括骨髓移植可能系解决上述问题的有效途径。

  近年来,相关骨髓干细胞移植及组织工程研究方兴未艾。应用到骨坏死的治疗也初见端倪。相关基础研究及临床应用已初显疗效,但问题不少,需进一步研究深化,提高。

一、  相关基础研究

  对非创伤性ONFH与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)之间的关系进行了较深入的研究,发现两者关系密切。因此,有些学者将非创伤性骨坏死称为骨髓MSCs病。于此,采用细胞治疗ONFH在临床试用。

(一)   红骨髓与骨坏死的关系。

  临床观察发现,无论是激素还是酒精引起的非创伤性骨坏死,其发生部位均在含黄骨髓的骨骼处,而富含红骨髓的骨骼,如髂骨、胸骨及椎体骨,罕见发生骨坏死。同时也发现,激素等引起的骨坏死,罕见于10岁以下的儿童(Legg-Perthes病本质上不属于骨坏死,而是骨骺软骨炎,其有完全的自行修复能力)。从而推测红骨髓具有对抗骨坏死的作用,也为红骨髓治疗骨坏死提供了线索。

  1.  非创伤性ONFH患者股骨近端及股骨头内骨髓MSC数量减少。此现象已被许多研究者报告。Hernigou发现激素引起的ONFH的股骨近端MSCs库中细胞数量下降。Weinstein等发现激素能使成骨细胞和骨细胞凋亡并抑制成骨的发生。中日友好医院骨坏死中心的王佰亮的研究也发现与股骨颈骨折患者相比,激素性ONFH股骨近端的MSCs增值活性明显下降,细胞生长曲线的平台期明显延缓,Go/G1细胞比例明显升高,S+G2/M期细胞比例降低,提示细胞增殖分裂的能力下降。Hofbauer等研究发现激素通过抑制成骨细胞的OPG(骨保护蛋白)的转录与表达,并促进ODF/OPGL(破骨细胞分化与受体激活)的表达从而激活破骨细胞,导致骨细胞数量下降。

  2. 非创伤性ONFH患者股骨近端的MSCs成脂增加,成骨减少。美国的王国照等早在上世纪90年代就证实,通过激素处理的MSCs成骨分化能力明显下降,而成脂分化能力增加。随后,崔全兴等也证实,暴露在酒精中的克隆骨髓细胞群成骨基因表达减少,成脂增加。殷力等证实,激素引起MSCs成脂增加,成骨减少,系通过成脂基因422(ap2)表达增加,甘油三酯合成增加,骨标志的基因表达及细胞减少所致。

  3. 许多动物实验都证实,应用浓集的骨髓单个核细胞(BM-MNCs)移植对坏死的股骨头有明显的修复作用,修复作用是通过成骨及成血管增加实现。张长青等应用家兔作骨坏死模型,进行单纯减压和自体BM-MNCs植入两组对比,发现注入细胞的动物坏死骨中新生血管形成,骨修复明显高于对照组。

  4. 骨髓间充质干细胞在体外实验,在给予成骨条件时(地塞米松和Vit C)培养可分化成为成骨细胞,继而成骨,但在体内条件能否成骨仍存疑问。Hernigou通过示踪标记骨髓基质干细胞,观察MSCs植入股骨头内保留情况,结果显示80%的移植细胞存留在股骨头坏死灶内,证明MSCs移植的可行性,但他未对MSCs的增殖、分化做进一步研究。中日友好医院骨坏死中心采用狗作模型,将狗的股骨头内做成缺损,采用石碳酸将骨缺损周围烧灼,致骨细胞死亡,做成类似人体股骨头坏死病灶清除后的骨缺损模型。应用自体骨髓MSCs,体外培养传代,并分别用Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)和SPIO(超顺磁性氧化铁)标记后,植入股骨头缺损区,结果显示,移植的MSCs能成活,标记的MSCs能停留在骨坏死及骨缺损部位,并能分化增殖。移植的标记的MSCs可分化为多种细胞,包括成骨细胞、骨细胞及成软骨细胞等。除成骨外,尚参与新生血管形成。实验还证实,将MSCs与人工骨复合后移植,可增加人工骨转化能力。

  5. 浓集BM-MNCs系采用密度梯度离心分层法收集。研究显示,采用此种技术,不同于单纯离心技术,密度梯度离心对骨髓血进行细胞分层,MSCs在离心时逐步富集于BM-MNCs层,使植入的富集的BM-MNCs中含MSCs的数量明显高于单纯离心技术所收集的MSCs。

  基于上述基础研究,证实浓集自体BM-MNCs用于治疗非创伤性ONFH是有效的。

  6. 关于伦理学和安全性。美国FDA规定,对自体组织和细胞,如仅通过物理方法处理(如浓集、分离等),未经添加化学成分或经培养基处理,是不必报请FDA批准的。浓集的自体BM-MNCs的植入如同自体成分输血,是不必经过伦理委员会批准,不存在伦理问题。但如加入培养基,经传代培养后再植入,则不属上述范畴。据笔者所知,目前国内尚未批准任何单位和部门在临床可植入经培养传代后的MSCs。浓集BM-MNCs植入自体用于治疗骨缺损、骨坏死、骨不连及脊椎融合术中代替植骨等已在国内外多家临床单位大量应用。目前尚未报告有副反应,应认为系安全的。

二、  临床应用

  法国的Hernigou被认为是最早应用浓集自体BM-MNCs治疗非创伤性ONFH的第一人。他在上世纪90年代初期应用全封闭COBE2991血液分离仪对采集与髂骨的骨髓血进行密度梯度离心,使单个核细胞(MSCs)从不同密度的成熟红细胞及血浆中分离出来。通过细针(3.2mm直径)从股骨大转子在X线透视监视下对股骨头坏死区钻孔,注入浓集的自体BM-MNCs,经对116例189髋非创伤性ONFH患者治疗,证实对ARCO分期中的Ⅰ、Ⅱ期ONFH有效。此文在2002年CORR杂志发表后,比利时、日本、韩国也陆续开展,并有所发展,疗效也进一步提高。

  中日友好医院骨坏死中心自2005年初引人此技术,至2011年6月,已在临床治疗ONFH 465髋,5膝、6踝、2肩骨坏死。同期上海九院的戴克戎将此技术用于临床治疗骨不连及代替骨移植行腰椎后路融合术,获得成功,并在国内外杂志报导。

(一)手术适应证和禁忌证
根据国内外文献报导及笔者所在的骨坏死中心试验,用于治疗骨坏死的浓集自体BM-MNCs的适应证为:
1. 单独应用:
①.  ARCO分期的ONFH中Ⅰ、Ⅱ期中的a,b型。
②.  年龄<50岁。
③.  无凝血及出血性疾病。
④.  无全身及局部感染。
⑤.  无贫血(Hb≥100g/L,WBC≥4×109/mm3)。
2. 与其它技术联合应用(病灶清除、植骨、截骨术等)。
①.  ARCO分期中的Ⅲa、Ⅱc。
②.  ARCO分期中的Ⅲb,年龄≤35岁。
3. 禁忌证
①.  血液系统病。
②.  局部感染。
③.  大面积、晚期骨坏死。
④.  骨髓增生病。
(二)必备设备
为使BM-MNCs获得成功,下述设备为必需。
1. 细胞密度梯度分离仪(COBE2991、COBE Spectra等)(图)。
2. 骨髓穿刺针及专用血液收集袋。
3. C形臂可移动X线机。

(三)手术技术

1. 骨髓血采集。
全身麻醉或者脊椎麻醉下,无菌条件在双髂嵴采集。为使采集的骨髓血含较多量的MSCs,应深浅多点,不同部位采集,将每次抽吸的骨髓血注入专用血袋中(内含抗凝剂)每例需吸取骨髓血200~400ml。
2. 骨髓血分离浓集。
将放置在血袋中的血过滤以除去血块和脂肪。在无菌室(放在手术室内即可),经全封闭血细胞处理仪(COBE细胞处理仪),利用密度梯度离心原理对采集并过滤后的骨髓血进行细胞分层选取。离心速度控制在3000r/min,离心5~10min。
骨髓血依密度梯度分层。由内向外依次为血浆层,单个核细胞层,成熟细胞层。MSCs在离心过程中逐步浓集在MSCs层中,通过分流管路,将骨髓的不同成分逐步抽出。
3. 股骨头髓心减压,BM-MNCs植入。
患者仰卧位放置在骨科牵引床上,C型臂X线透视监视下,经大转子下,1mm克氏针作导针穿入坏死病灶中,针尖在距软骨下骨板3~5mm。确定位置后,由导针导入3.5~4mm的环钻,对骨坏死区作髓心减压,应在坏死区不同部位可行3~5处减压,然后将浓集的BM-MNCs通过环钻套筒缓慢注入坏死减压区,完成后用腊封堵减压孔外口,以防骨髓血渗漏。
与其它技术联合应用时,应将浓集的BM-MNCs与人工骨充分混合。戴克戎等的方法是将浓集的BM-MNCs与人工骨(β-TCP)颗粒物理方法混合后,置于50ml的注射针筒内,负压吸吸8~10次,尽量排除多孔材料内的气体,促进骨髓血进入多孔颗粒材料内部,然后置于37℃ 5%CO2培养箱中复合1.5~2h,制成含MSCs/β-TCP复合材料,植入骨缺损区。
治疗ONFH或其它部位骨坏死,可在减压后注入1/2量的浓集BM-MNCs,剩余1/2量与人工骨按上述方法复合后植入。
日本Yamasaki的方法是将浓集的BM-MNCs浓集成40ml左右,放置于多孔钙羟基磷灰石(HA)制成的棒内,经大转子股骨头减压及病灶清除后植入。

(四)  临床疗效

各临床单位报告,发现对早期(Ⅰ、Ⅱ期)中小面积坏死的ONFH疗效是肯定的,对中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)坏死面积大(C型)疗效有待提高。
Hernigou报告189髋,采用髓心减压后注入BM-MNCs,随访7年(5~10年),ARCO分期中Ⅰ、Ⅱ期转为全髋关节置换术(THA)者9/145,占6.2%;而ARCOⅢ、Ⅳ期的44髋转为THA者为25髋,占56.8%。
比利时的Gangi采用对照研究,18髋ARCOⅠ、Ⅱ期ONFH,随访18月,对照组仅采用髓心减压,治疗组采用髓心减压加浓集BM-MNCs植入,结果显示对照组中8髋中5髋进展到股骨头塌陷,而治疗组的10髋仅1髋进展到塌陷,差别有统计学意义。
日本的Yamasaki对22例30髋按日本分类法的Ⅰ至Ⅲ期的ONFH行浓集自体BM-MNCs移植,他将骨髓细胞置于β-TCP棒内(直径约5~8mm),经股骨大转子行股骨头坏死灶减压,病灶清除后植入混有BM-MNCs的β-TCP1~2根,随访29月(19~35),植入骨髓血组30髋仅1髋行THA,关节评分由14.7分增加至17分(欧洲评分18分为最优);而对照组仅作减压,9髋中3髋进展到行THA,关节评分由15.2减少为14.2。治疗组X线片显示无塌陷占56.7%,塌陷≤2mm为33.3%,塌陷≥2mm占10%。
中日友好医院骨坏死中心对45例59髋ONFH行髓心减压,浓集自体BM-MNCs植入的病例进行了平均27.6月(12~40)的随访,以Harris评分大于80分评为优良(其中疼痛≥30分),ARCO分期中的Ⅰ、Ⅱ期优良率达88%,而ARCO分期的Ⅲa期的优良率仅为44.4%。对Ⅲa期患者联合其它技术治疗则优良率明显升高。

(五)  如何确保BM-MNCs植入的疗效。

很明显,浓集自体BM-MNCs植入治疗ONFH的疗效依赖于适应证的选择,手术技术等。除此之外,与患者年龄及吸取骨髓量等也密切相关。
为确保植入股骨头坏死灶的BM-MNCs数量,除穿吸技术外,吸取的骨髓量也相当重要(表1)
表1  各研究者骨髓吸取量及MNCs数
研究者
骨髓血量
浓集前MNCs数
浓集后MNCs数
Hernigou
150ml
16.41±11.5×106/ml
40.3±5×106/ml
Gangi
400ml
14×106/ml
40±5×106/ml
戴克戎
250ml
16±4×106/ml
43±5×106/ml
Yoshioka
300ml
0.39±0.38×107/ml
5.32±2.08×107/ml
Yamasaki
700ml

1×109/ml
中日友好医院
200ml
12.33±3.2×106/ml
25.23±12×106/ml
从表中显示,吸取的骨髓血应在200ml以上,这样才可确保足够的MNCs数量,据估计每104或105的MNCs中含有一个MSCs。

三、  存在的问题及展望

浓集自体BM-MNCs治疗ONFH的疗效是肯定的。但各位学者报告的疗效差别很大,说明移植技术的规范,并作进一步改进均有空间,以此,可使疗效有可重复性。
(一) 主要存在的问题
1. 关于患者年龄。
目前应用BM-MNCs治疗ONFH的比较研究发现,年龄与疗效关系密切。年龄轻者(≤40岁)与年龄较大者(≥50岁)有显著差异。其原因系BM-MNCs中含有MSCs的数量减少及MSCs的增殖能力下降所致。因此,目前提倡在年青中应用此法,用于50岁以上的中老年宜慎重。但如有新技术介入,有希望扩大年龄范围。
2. 如何进一步提高植入的MSCs的成骨及成血管能力系目前应为进一步研究的课题。体外培养、定向成骨及成血管肯定是其中的有效措施之一,但鉴于目前采用胎牛血清进行细胞培养,植入人体后的潜在问题仍难以预定,故暂不能用于临床。如能采用自体血清培养基或无培养基扩增,有望在临床应用。
3. 目前无论是骨髓干细胞移植,还是组织工程骨植入,影响临床疗效的最大的障碍是细胞或组织植入后如何从宿主骨中获得足够的营养,以使植入的细胞存活、分裂、增殖。无论从动物实验还是临床病例观察,发现植入的骨髓干细胞成骨和成血管仅限于病灶清除后邻近宿主骨的缺损边缘部,而植入缺损区的中央部与人工骨或导体骨混合的骨髓干细胞仍不能成活,人工骨仍难以转化。如何使植入体内的细胞及人工骨获得持续的、足够的营养仍是需进一步研究的课题。
为解决较大的骨缺损处(坏死病灶清除后)植入的骨髓细胞仅在边缘成骨的缺陷,中日友好医院骨坏死中心尝试二次BM-MNCs植入手术,即在初次移植术后缺损区边缘成骨的基础上,3~6月后再作钻孔,植入BM-MNCs,期望修复骨量增加,修复骨厚度增加而达到抗压防止股骨头塌陷。
从目前研究看,进一步提高自体浓集BM-MNCs的临床疗效有下述展望。
1. 采用一种新的血液分离仪(Harvest BMAC系统)代替现在应用的分离仪,收集骨髓血中的全部核细胞(bone marrow total nucleated cells , BMTMCs),而不仅收集单个核细胞(BM-MNCs)可望提高组织修复能力,特别是新生血管的修复能力,已在动物实验证实,但未在临床应用。
2. 收集周围血中CD34阳性细胞,在病灶植入BM-MNCs的同时静脉注入,有望提高疗效。动物实验已显示,人体CD34阳性细胞可促进成血管及成骨能力,其机制是CD34细胞具有潜在的分化为血管内皮细胞和成骨细胞的可能。由于收集的自体血,故不存在免疫排斥及伦理问题,可望在临床应用。
3. 收集自体血小板凝胶(platelet gel)与BM-MNCs同时使用。血小板凝胶含有多量的生长因子(GF),包括bGFG、PDGF、VEGF等。因为血小板在周围血中含量丰富,但骨髓血在分离后,血小板含量不高,因此在作BM-MNCs移植时,加入从周围血中分离的血小板凝胶,有望提高修复能力。
4. 通过胎儿脐带血或羊膜等获取更多的MNCs。羊膜是受精卵在发育为胚胎过程中的胚体以外的附属结构,位于胎儿绒毛膜表面,为光滑、无血管、无神经、无淋巴的透明薄膜,厚约0.02~0.05mm。光学显微镜显示,羊膜组织由上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层组成。研究显示4cm2的羊膜产生原代的人羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal cells,hAMCs)为1.3~1.5×106/mm之间,而人的羊膜为1300cm2,因而hAMCs可达4×108。研究表明hAMCs的扩增能力优于成人的BM-MNCs,且可在骨缺损处成骨和成血管。羊膜组织无免疫原性,是产后废弃物,无伦理问题,有望替代骨髓血且临床效果更优。
总之,浓集自体BM-MNCs对部分ONFH有治疗价值,但需改进并有新的技术引入后,有望扩大适应范围,更加提高疗效。

(来源:中日友好医院 李子荣  王佰亮)

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